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1.
Biomédica (Bogotá) ; 41(4): 773-786, oct.-dic. 2021. tab, graf
Article in English | LILACS | ID: biblio-1355749

ABSTRACT

Abstract | Introduction: Next Generation Sequencing (NGS) is cost-effective and a faster method to study genes, but its protocol is challenging. Objective: To analyze different adjustments to the protocol for screening the BRCA genes using Ion Torrent PGM sequencing and correlate the results with the number of false positive (FP) variants. Materials and methods: We conducted a library preparation process and analyzed the number of FP InDels, the library concentration, the number of cycles in the target amplification step, the purity of the nucleic acid, the input, and the number of samples/Ion 314 chips in association with the results obtained by NGS. Results: We carried out 51 reactions and nine adjustments of protocols and observed eight FP InDels in homopolymer regions. No FP Single-Nucleotide Polymorphism variant was observed; 67.5% of protocol variables were jointly associated with the quality of the results obtained (p<0.05). The number of FP InDels decreased when the quality of results increased. Conclusion: The Ion AmpliSeq BRCA1/BRCA2 Community Panel had a better performance using four samples per Ion-314 chip instead of eight and the optimum number of cycles in the amplification step, even when using high-quality DNA, was 23. We observed better results with the manual equalization process and not using the Ion Library Equalizer kit. These adjustments provided a higher coverage of the variants and fewer artifacts (6.7-fold). Laboratories must perform internal validation because FP InDel variants can vary according to the quality of results while the NGS assay should be validated with Sanger.


Resumen | Introducción. La secuenciación de nueva generación es un método rentable y rápido para el estudio de los genes, pero su protocolo entraña desafíos. Objetivo. Investigar diferentes ajustes del protocolo de selección de los genes BRCAmediante secuenciación de Ion Torrent PGM™ y correlacionar los resultados con el número de variantes de falso positivo. Materiales y métodos. El proceso de preparación de la biblioteca, el número de falsos positivos InDels, la concentración de la biblioteca, el número de ciclos en el paso de amplificación de objetivos, la pureza del ácido nucleico, la entrada y el número de muestras por chip del Ion-314 se analizaron en asociación con los resultados obtenidos por secuenciación de nueva generación secuenciación de nueva generación. Resultados. Se hicieron 51 reacciones y nueve ajustes de los protocolos, y se observaron ocho falsos positivos InDels en las regiones de homopolímeros. No se observó ninguna variante de polimorfismo de nucleótido simple falso positivo. En 67,5 % de los casos, las variables de protocolo en su conjunto se asociaron con la calidad de los resultados obtenidos (p<0,05). El número de falsos positivos InDels disminuyó al aumentar la calidad de los resultados. Conclusiones. El panel comunitario Ion AmpliSeq BRCA1/BRCA2 tuvo un mejor rendimiento, con cuatro muestras por chip Ion-314 en lugar de ocho, y el número de ciclos en el paso de amplificación, incluso con ADN de alta calidad, fue mejor con 23. Se observaron mejores resultados con el proceso de ecualización manual y sin el uso del kit Ion Library Equalizer. Estos ajustes proporcionaron una mayor cobertura de las variantes y menos artefactos. Los laboratorios deben realizar la validación interna porque las variantes de falsos positivos InDel pueden variar según la calidad de los resultados. La secuenciación de próxima generación debe validarse con Sanger.


Subject(s)
DNA , High-Throughput Nucleotide Sequencing , Sequence Analysis , Genes, BRCA1 , Genes, BRCA2
2.
Arch. Health Sci. (Online) ; 27(1): 78-81, jan-mar.2020.
Article in Portuguese | LILACS-Express | LILACS | ID: biblio-1369549

ABSTRACT

Introdução: A doença de Huntington (DH) é uma desordem neurodegenerativa autossômica dominante e rara, com comprometimento motor, cognitivo e comportamental. O início dos sintomas precoces, com menos de 20 anos, caracteriza a forma infanto-juvenil da DH. O acompanhamento da evolução da doença é importante e permite determinar as limitações funcionais e motoras de acordo com a progressão de cada caso. Objetivo: Relatar um caso juvenil da doença de Huntington associando o genótipo e o fenótipo. Métodos: A escala Unified Huntington's Disease Rating Scale (UHDRS), validada em português, foi aplicada por um profissional capacitado, utilizando as seções: Avaliação do Estado Funcional (FAS), Escala de Capacidade Funcional Total (TFC) e Escala de Independência (IS). Resultados: O indivíduo investigado é do sexo masculino com início dos sintomas motores aos 18 anos. Em 2019, o jovem tinha 12 anos de tempo de doença e foi diagnosticado com DH, com alelos em heterozigose com 19 e 53 repetições CAG. As avaliações realizadas com a escala UHDRS associadas à avaliação funcional e motora, obtiveram os seguintes escores: UHDRS FAS = 18 pontos, UHDRS TFC =12, UHDRS IS = 90%e UHDRS TMS = 57 pontos. Conclusão: Pela variabilidade clínica associada à forma juvenil, o paciente deve ter tratamento personalizado, condizente com o comprometimento motor, funcional e comportamental apresentado. A UHDRS é escala mais indicada para avaliar indivíduos afetados pela DH, principalmente pelo alto grau de consistência e confiabilidade clínica.

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